直接透射拉曼测量用于分析胶囊中的药物具有优势，因为它们可以以非破坏性的方式确定药物活性成分（API）的浓度，并且与传统的后向散射测量相比，胶囊本身的荧光背景干扰要小得多。如果可以使用单一校准模型（例如从玻璃小瓶中简单收集的光谱开发的模型）来确定不同颜色胶囊中样本的API浓度，而不是为每种胶囊颜色构建单独的模型，那么透射测量的实用性将得到进一步增强。
为了评估这种可行性，我们在玻璃小瓶中收集了盐酸氨溴索和乳糖的二元混合物的透射拉曼光谱，并开发了一个用于确定盐酸氨溴索浓度的偏最小二乘法（PLS）模型。然后，该模型被直接应用于确定4种不同颜色（蓝色、绿色、白色和黄色）胶囊中样本的盐酸氨溴索浓度。尽管当样本放置在蓝色或绿色胶囊中时，由于存在微弱的荧光，预测性能略有下降，但在所有情况下，盐酸氨溴索的准确测定通常都能实现。当胶囊的厚度发生变化时，预测精度也得到了研究。
一、引言
透射拉曼光谱法最近被证明是一种有效且非破坏性的分析多种药物产品的方法。与传统的后向散射测量相比，胶囊中样本的透射拉曼测量具有特别的优势，因为胶囊本身的荧光不利影响可以大大减少。Matousek团队率先在药物领域应用透射拉曼光谱法，展示了减少荧光背景以及对完整多组分药物胶囊进行定量分析的可能性。
展开剩余94%为了提高直接透射拉曼测量胶囊中样本的实际应用性，仍需解决几个问题。首先，需要考察根据胶囊发出的荧光程度变化的测量准确性。如前所述，通过采用透射光谱收集方案，胶囊本身产生的荧光可以大幅减少；然而，当荧光较强时，它可能会与样本的拉曼特征重叠。因此，必须评估荧光程度与透射拉曼测量准确性之间的关系。其次，研究使用透明容器（如玻璃小瓶）中的样本开发的校准模型是否可以直接用于分析不同颜色胶囊中的相同样本，而不是为每次测量单独构建校准模型，这将使透射拉曼测量更加简单且更容易在科学实践中采用。第三，由于胶囊的厚度可能不同，必须确定胶囊厚度对样本透射拉曼特征的影响。胶囊可能会产生荧光，并且作为屏障减弱胶囊内样本的拉曼信号。荧光和拉曼信号衰减的程度会根据胶囊的厚度以及颜色而变化。
这些问题在本研究中进行了调查。制备了盐酸氨溴索和乳糖的二元混合物，并收集了四种不同颜色（蓝色、绿色、白色和黄色）胶囊中样本的透射拉曼光谱。还将相同的样本转移到内径与胶囊相同的玻璃小瓶中以收集透射拉曼光谱，以评估在不受胶囊影响的情况下盐酸氨溴索浓度测定的准确性。这种比较作为标准，用于比较胶囊测量的准确性。使用每个胶囊收集的光谱数据集，通过偏最小二乘法（PLS）确定盐酸氨溴索浓度，并根据胶囊颜色比较结果准确性。接下来，使用从玻璃小瓶数据集中开发的PLS模型，使用在四种不同胶囊中收集的光谱预测盐酸氨溴索浓度，并检查预测准确性。最后，通过增加胶囊层数至8层，收集了12.5%盐酸氨溴索样本的透射拉曼光谱。然后，检查每个胶囊中样本的透射光谱，并结合胶囊颜色评估胶囊厚度对预测准确性的影响。
二、实验
2.1 样本和拉曼光谱收集
通过混合适当量的盐酸氨溴索和乳糖粉末（Sigma–Aldrich），制备了15种不同浓度的盐酸氨溴索样本（范围：9.0%–16.0%，增量为0.5%）。将混合样本（总重350毫克）转移到四种不同颜色（蓝色、绿色、白色和黄色）的胶囊和玻璃小瓶中以收集光谱。胶囊帽和胶囊体的内径分别为6.40毫米和6.26毫米。胶囊厚度为0.10毫米。玻璃小瓶的内径和厚度分别为6.26毫米和0.93毫米。
通过直接照射785纳米激光辐射（Innovative Photonic Solutions，Monmouth Junction，NJ，USA）收集透射拉曼光谱。激光光斑的大小调整为1毫米直径，相应功率在胶囊表面为250毫瓦。使用宽区域照明（WAI）方案（PhAT系统，Kaiser Optical Inc.，Ann Arbor，MI，USA）在激光照射的对面收集拉曼散射，该方案与之前研究中用于收集黄色胶囊中样本的后向散射拉曼光谱的设置相同。使用3秒曝光时间和80次累积收集拉曼光谱（分辨率：4厘米⁻¹）。每个样本收集三份光谱。对于三份测量，将装有盐酸氨溴索样本的胶囊摇晃并重新定位，以确保样本随机排列以及胶囊方向随机。
还使用WAI方案（激发波长=785纳米）收集了样本的后向散射拉曼光谱，该方案能够覆盖较大的样本面积（面积：28.3平方毫米），以提高样本的代表性。将胶囊置于WAI方案的焦点处以收集后向散射拉曼光谱。所有计算，包括基线校正、归一化、主成分分析（PCA）和PLS回归，均使用MATLAB版本7.0（The Math-Works Inc.，MA，USA）进行。在进行PCA和PLS之前，所有光谱均进行了均值中心化。对于PLS，15个样本中，11个（33份光谱）和4个（12份光谱）分别被分配到校准集和验证集，用于完全交叉验证。
三、结果与讨论
3.1 纯样本和空胶囊的后向散射拉曼光谱特征
图1显示了纯盐酸氨溴索（黑色）和乳糖（红色）粉末在1485–300厘米⁻¹范围内的拉曼光谱。每种纯样本被转移到石英比色皿中，并使用WAI方案在后向散射模式下收集相应的光谱。由于分子结构的差异，盐酸氨溴索和乳糖的拉曼光谱特征不同，如之前出版物所述。盐酸氨溴索在1036、822和789厘米⁻¹处的带强度比其他带更强，而822和789厘米⁻¹处的带与乳糖的带重叠较少。这两个强拉曼带对于确定混合物中盐酸氨溴索的浓度很有价值。
图1. 纯盐酸氨溴索（黑色）和乳糖（红色）粉末在1485–300厘米⁻¹范围内的拉曼光谱。（对于图例中颜色的解释，请参考文章的网页版本。）
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图2显示了四种不同颜色空胶囊在1485–300厘米⁻¹范围内的拉曼光谱。使用后向散射方案收集光谱。如图所示，在785纳米激发下，蓝色和绿色胶囊均表现出荧光，但它们的荧光模式略有不同。蓝色胶囊的荧光形状更弯曲且比绿色胶囊更强。与此同时，白色和黄色胶囊未观察到显著荧光，因此它们的强度远低于蓝色和绿色胶囊。白色和黄色胶囊的拉曼光谱在图中进一步放大以便详细检查。对应于胶囊成分（明胶、琼脂糖、阿拉伯胶、着色剂和防腐剂）的特征在白色和黄色胶囊的情况下清晰且相似，而在蓝色和绿色胶囊的光谱中，由于与荧光背景重叠，这些特征几乎无法观测到。预计蓝色或绿色胶囊发出的荧光会在直接分析这些胶囊中的样本时对盐酸氨溴索浓度的测定产生不利影响。
图2. 四种不同颜色（蓝色、绿色、白色和黄色）空胶囊在1485–300厘米⁻¹范围内的拉曼光谱。为了详细检查，白色和黄色胶囊的光谱在图中进一步放大。（对于图例中颜色的解释，请参考文章的网页版本。）
3.2 不同颜色胶囊中盐酸氨溴索样本的后向散射拉曼光谱特征
图3（a）显示了12.5%盐酸氨溴索样本的三份后向散射拉曼光谱，涵盖了所有四种胶囊颜色以及玻璃小瓶，在1485–300厘米⁻¹范围内。如预期的那样，蓝色和绿色胶囊收集的光谱中荧光背景占主导地位，而白色和黄色胶囊收集的光谱强度较低，因为没有荧光。为了更仔细地检查，分别在图3（b）和（c）中突出了蓝色和绿色胶囊收集的光谱。尽管样本的拉曼带出现在荧光背景的顶部，但由于与荧光信号重叠，它们的特征变得模糊且不那么明显。图3（d）分别显示了同一样本在白色胶囊、黄色胶囊和玻璃小瓶中的光谱。在没有荧光影响的情况下，可以清晰地观察到明显的拉曼带，这三种测量的整体光谱特征几乎相同。然而，玻璃小瓶收集的拉曼带强度比白色和黄色胶囊获得的强度更强。玻璃是透明的，因此可以收集到更强的拉曼信号。此外，在1485–1200厘米⁻¹范围内样本带下方还存在玻璃本身的弱而宽的拉曼特征。总体而言，当胶囊在给定激发波长下发荧光时，后向散射拉曼特征会受到直接影响。
图3.
3.3 不同颜色胶囊中盐酸氨溴索样本的透射拉曼光谱特征
图4显示了四种不同颜色胶囊和玻璃小瓶中的相同12.5%盐酸氨溴索样本的三份透射拉曼光谱。在蓝色和绿色胶囊的透射光谱中，对应于后向散射光谱中存在的强烈荧光背景几乎消失。每个胶囊在总采样体积中所占的体积百分比很小（大约1.5%），因此荧光强度应该大大降低，正如之前的研究所证明的那样。蓝色胶囊获得的光谱基线强度高于其他胶囊。这表明尽管采用了透射测量，蓝色胶囊产生的荧光仍然存在于样本的光谱中。其他胶囊的透射光谱特征几乎相同，基线强度相似，而玻璃小瓶获得的光谱基线略高。在透射光谱中，玻璃本身的弱而宽的拉曼特征在1485–1200厘米⁻¹范围内不再出现。总体而言，当采用透射光谱收集时，样本的拉曼带清晰可见，其特征与胶囊颜色无关。尽管使用了高度荧光的蓝色胶囊进行测量，荧光的影响也大大减少。显然，当样本放入蓝色或绿色胶囊中时，通过采用透射拉曼测量可以更准确地确定盐酸氨溴索的浓度。
图4. 四种不同胶囊和玻璃小瓶中的12.5%盐酸氨溴索样本的透射拉曼光谱。（对于图例中颜色的解释，请参考文章的网页版本。）
为了更系统地理解透射光谱特征，通过三种不同的方式收集了12.5%盐酸氨溴索样本的透射光谱。首先，将空胶囊纵向切成两半，并将半胶囊放在玻璃小瓶的左侧（称为“胶囊在左”）进行透射光谱收集。激光的照射方向是从左到右。其次，将半胶囊放在玻璃小瓶的右侧（称为“胶囊在右”）以收集透射光谱。第三，将两个半胶囊放在玻璃小瓶的两侧进行光谱采集（称为“胶囊在两侧”）。只有表现出强荧光的蓝色和绿色胶囊通过这些光谱收集方案进行了测试。
图5显示了使用蓝色胶囊通过上述三种方案收集的12.5%盐酸氨溴索样本的透射拉曼光谱。每种方案收集的六个重复光谱均显示出来。胶囊在左和胶囊在两侧测量的荧光背景强度相似，但胶囊在左测量的强度略高。这一结果表明，荧光背景主要来自胶囊的左侧，即激光束最初照射的位置，用于透射光谱收集；而胶囊右侧的荧光贡献最小。由于激光功率在到达胶囊右侧时会因散射而大大降低，因此荧光强度在胶囊在右测量的情况下大幅减少。
图5. 使用蓝色胶囊通过三种不同方案（胶囊在左、胶囊在右和胶囊在两侧）收集的12.5%盐酸氨溴索样本的透射拉曼光谱。（对于图例中颜色的解释，请参考文章的网页版本。）
图6显示了使用绿色胶囊通过相同方案收集的12.5%盐酸氨溴索样本（1485–300厘米⁻¹范围）的透射拉曼光谱。对于蓝色胶囊，胶囊在左测量的荧光背景强度最强，胶囊在两侧测量的强度略有下降，胶囊在右测量的强度大幅减少。再次清楚地表明，与样本峰重叠的荧光主要来自胶囊的左侧。此外，胶囊的右侧会减弱样本的拉曼信号。比较胶囊在左和胶囊在两侧测量的光谱，发现绿色胶囊的右侧比蓝色胶囊更显著地减弱了样本的整体拉曼信号。
图6. 使用绿色胶囊通过三种不同方案（胶囊在左、胶囊在右和胶囊在两侧）收集的12.5%盐酸氨溴索样本的透射拉曼光谱。（对于图例中颜色的解释，请参考文章的网页版本。）
3.4 透射胶囊测量的重现性
尽管采用透射拉曼光谱收集可以大大减少荧光的影响，但它并没有完全消失，当使用蓝色或绿色胶囊时。即使是微弱重叠的荧光背景也可能对拉曼测量的准确性产生不利影响。因此，值得研究当使用不同胶囊时透射测量的重现性。再次使用1485–300厘米⁻¹范围来评估重现性。在六个不同的波数（1485、1181、806、680、536和300厘米⁻¹）处校正原始光谱的基线，并计算1485–300厘米⁻¹范围下的峰面积。然后，将每个校正后的光谱除以相应的峰面积进行归一化。评估盐酸氨溴索在822厘米⁻¹处的带变化。为了突出822厘米⁻¹带的微小光谱差异，使用从相应归一化光谱获得的二阶导数光谱。
图7显示了在不同胶囊玻璃小瓶中收集的12.5%盐酸氨溴索的三份二阶导数光谱，其中突出显示了822厘米⁻¹处的主要盐酸氨溴索带。每种测量的三份光谱在带形状和位置方面通常相似。为了详细调查三份光谱之间的光谱差异，如图中插图所示放大了该带。插图中的光谱被任意偏移以便清晰比较。在蓝色和绿色胶囊中收集的三份光谱之间的带位置有微小变化，而其他情况下则一致。荧光导致光谱特征的重现性略有下降，例如带位置的微小变化。
为了定量确定收集的透射光谱的重现性，使用1485–300厘米⁻¹范围内的归一化光谱进行主成分分析（PCA）。首先计算每个样本的三个第一得分值的标准差。然后，对于每种胶囊测量，计算出15个样本的15个标准差值的平均值。每种胶囊测量得到的平均标准差及其相应的不确定性如表1所示。蓝色和绿色胶囊的透射测量的标准差较大，表明三份光谱之间的光谱特征重现性较差。重现性较差可能会对盐酸氨溴索浓度的测定准确性产生不利影响。
表1.每种胶囊测量的三份光谱的第一得分值的平均标准差。
图7. 在四种不同胶囊和玻璃小瓶中收集的12.5%盐酸氨溴索的三份二阶导数光谱，其中突出显示了822厘米⁻¹带。为了详细检查，如图中插图所示放大了该带。插图中的光谱被任意偏移以便清晰比较。（对于图例中颜色的解释，请参考文章的网页版本。）
3.5 盐酸氨溴索浓度的测定
使用偏最小二乘法（PLS），评估了每种透射测量对盐酸氨溴索浓度测定的准确性。在所有情况下，均使用1485–300厘米⁻¹范围内的归一化光谱进行PLS。通过在每个数据集中对所有样本进行完全交叉验证获得相应的误差。在15个样本中，校准集和验证集的样本数量分别分配为11和4。在所有可能的组合中选择4个样本进入验证集时，计算相应的校准标准误差（SEC）和预测标准误差（SEP）。然后，通过分别平均这些SEC和SEP，获得平均校准标准误差（MSEC）和平均预测标准误差（MSEP）。
每种胶囊测量得到的MSEC和MSEP总结在表2中。所有情况下均使用两个因子。图8显示了从每次测量中获得的预测相关性（实际浓度与预测浓度）。（对于图例中颜色的解释，请参考文章的网页版本。）
表2.每种胶囊测量的PLS准确性结果。
图8. 从每次测量中获得的预测相关性（实际浓度与预测浓度）。（对于图例中颜色的解释，请参考文章的网页版本。）
如图8所示，蓝色和绿色胶囊测量的浓度相关性相对更分散，而其他测量的相关性更接近理想直线。根据《韩国药典》，使用HPLC定量分析盐酸氨溴索时，可接受的限度为95–105%，当一个样本中包含43.75毫克盐酸氨溴索（占总350毫克的12.5%）被指定为100%盐酸氨溴索时。这相当于分析12.5%盐酸氨溴索样本时的范围为11.88%至13.13%。如表2所示，每种测量得到的准确性（MSEP）与HPLC相当。
白色胶囊的盐酸氨溴索浓度测定最为准确，而蓝色和绿色胶囊的准确性降低。蓝色胶囊发出的强荧光进一步降低了盐酸氨溴索测定的准确性。如果对蓝色或绿色胶囊中的样本进行后向散射测量，由于荧光的直接影响，预期结果的准确性将不令人满意，如图3（a）所示。黄色胶囊和玻璃小瓶的MSEP几乎相同，且接近白色胶囊的MSEP。蓝色和绿色胶囊测量的准确性降低在与玻璃小瓶测量的准确性比较时，在95%置信水平上具有统计学意义。
从实际角度来看，可能使用多种颜色的胶囊来盛装相同的药物样本。因此，如果使用玻璃小瓶中的盐酸氨溴索样本开发的单一PLS模型能够准确预测不同颜色胶囊中收集的样本的盐酸氨溴索浓度，那么透射测量的实用性将大大提高。由于在四种不同胶囊和玻璃小瓶中获得的盐酸氨溴索样本的透射光谱特征相似，如图4所示，使用单一PLS模型是可行的。
为了评估可行性，最初使用在玻璃小瓶中收集的所有15个样本的光谱开发了一个PLS模型。再次使用两个因子。然后，使用开发的模型，分别预测了在四种不同胶囊中收集的所有15个样本。当分别预测蓝色、绿色、白色和黄色胶囊中收集的光谱时，相应的SEP分别为0.58%、0.36%、0.26%和0.30%。除了预测蓝色胶囊中的样本外，SEP与表2中每种胶囊颜色单独使用每个PLS模型时获得的SEP相似。由于这些胶囊获得的透射光谱特征几乎与玻璃小瓶中获得的相同，因此保持了预测准确性。然而，在预测蓝色胶囊中的样本时，SEP进一步恶化。由于PLS模型是使用无荧光的光谱开发的，因此当预测即使有轻微荧光重叠的光谱时，预测准确性可能会更敏感地降低。对于高度荧光胶囊中的药物透射拉曼测量，使用相同颜色胶囊中收集的光谱会是一个更好的选择，因为它会在PLS模型中反映荧光的存在。然而，当采用能够选择性消除或最小化重叠荧光背景的复杂策略时，使用单一校准模型进行不同颜色胶囊的透射测量在实际应用中是可行的。
3.6 不同胶囊厚度下透射光谱特征的变化
本研究中使用的胶囊厚度为0.10毫米。如预期的那样，样本的透射拉曼光谱特征会随着胶囊厚度的变化而变化。为了说明这种变化，通过增加胶囊层数至8层（相当于0.8毫米厚度），收集了12.5%盐酸氨溴索的透射拉曼光谱。图9显示了在蓝色（a）、绿色（b）、白色（c）和黄色（d）胶囊中不同层数下收集的样本的透射拉曼光谱。
图9. 在蓝色（a）、绿色（b）、白色（c）和黄色（d）胶囊中不同层数下收集的12.5%盐酸氨溴索样本的透射拉曼光谱。（对于图例中颜色的解释，请参考文章的网页版本。）
在蓝色胶囊的情况下（图9（a）），随着层数的增加，荧光背景的强度相应增加，背景的形状也变得更加弯曲。厚度的增加显然导致了更强的荧光强度。样本的拉曼峰出现在荧光背景上；然而，随着厚度的增加，这些峰逐渐变得不那么明显。更强的荧光背景使样本的盐酸氨溴索光谱特征更加模糊。
在绿色胶囊的情况下（图9（b）），随着胶囊层数的增加，整体背景强度以及样本带的拉曼强度显著下降。样本的拉曼带只能观察到6层，表明绿色胶囊的右侧对生成的拉曼信号的衰减占主导地位。当在白色和黄色胶囊中收集光谱时，基线和拉曼峰的强度随着胶囊厚度的增加而降低。然而，这些胶囊对拉曼信号的衰减程度比绿色胶囊低得多，因此即使在0.8毫米厚度（8层）时，样本的拉曼带仍然可以观察到，尽管它们的强度相对降低。总体而言，在蓝色和绿色胶囊的情况下，样本的拉曼特征会随着厚度的变化而敏感变化，使用较薄的胶囊更有优势，以保持样本的特征清晰并最小化荧光的存在。与此同时，白色和黄色胶囊的厚度略有变化并不会严重影响样本的光谱特征。
使用从玻璃小瓶数据集中开发的PLS模型，直接预测了不同厚度胶囊中收集的12.5%盐酸氨溴索样本的光谱。在预测之前，如上所述对光谱进行了基线校正和归一化。图10显示了随着胶囊厚度增加，预测的盐酸氨溴索浓度的变化。在白色胶囊的情况下，无论胶囊厚度如何变化，预测的盐酸氨溴索浓度都是准确且一致的。对于黄色胶囊，样本的盐酸氨溴索预测在0.4毫米厚度以下准确，之后则降低。对于蓝色和绿色胶囊，预测性能甚至在0.2毫米厚度时就开始恶化，而蓝色胶囊的恶化更为显著。
图10. 随着胶囊厚度增加，预测的盐酸氨溴索浓度的变化。虚线表示盐酸氨溴索的参考浓度（12.5%）。（对于图例中颜色的解释，请参考文章的网页版本。）
我们的结果清楚地表明，胶囊厚度的变化直接影响透射拉曼测量的准确性，特别是当样本被装在高度荧光的胶囊中和/或样本生成的拉曼信号被大幅衰减时。当胶囊是非荧光的和/或对拉曼信号衰减较小时，胶囊厚度的微小变化不会严重影响透射测量的准确性。
四、结论
在本研究中，我们证明了使用玻璃小瓶中收集的药物样本光谱开发的校准模型直接分析装在不同颜色胶囊中的相同样本的可行性，而不是为每种胶囊颜色单独构建校准模型。这是非常有利的，因为可以大大减少开发和管理多个校准模型以进行常规分析的工作量。一种能够抑制胶囊本身发出的荧光影响的复杂策略，将通过允许无论胶囊颜色如何都能确定药物活性成分（API）浓度，增强直接透射测量通过胶囊的实用性和鲁棒性。未来的研究将致力于开发专门用于消除透射拉曼光谱中由胶囊产生的重叠荧光的有效数学方法。
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